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齐墩果酸对纤维素酶活性的影响

导读:观察齐墩果酸对纤维素酶活性的影响,探讨利用纤维素酶从天然植物中分离提取齐墩果酸的可能性。


返回列表 来源:未知 发布日期:2019-11-28 10:35【

20 世纪 90 年代中期,我国出现了应用酶技术分 离中草药有效成分的相关报道。近年来,应用酶 技术提取分离中草药的有效成分取得了不少新成果, 尤其是应用纤维素酶以破坏细胞壁的致密结构,加速 有效成分的溶出进而提高提取率的方法受到了行业 内的认可。目前已有许多科研工作者从中草药中 分离出了有效的活性成分,如张利等利用纤维素酶提 取了广陈皮中的橙皮苷; 孙晓玲利用纤维素酶结合乙 醇的提取方法,提取了生姜中的总黄酮; 薛天乐等利 用纤维素酶从白芷茎中提取了总香豆素。

1 材料与方法

1. 1 材料与仪器

羧甲基纤维素钠和纤维素酶购于 Sigma 公司; 齐 墩果酸购于西安文竹生物科技有限公司; 3,5-二硝基 水杨酸、酒石酸钾钠、苯酚和无水亚硫酸钠均购于国 药集团化学试剂有限公司; NaOH 购于西陇化工股份 有限公司。 UV-2700 紫外分光光度计购于岛津公司; HH-4 数显恒温水浴锅购于江苏省金坛市友联仪器研究所; 昆山舒美KQ-700DA 超声波清洗器购于昆山舒美超声仪器有 限公司; BS224S-CW 电子分析天平购于赛多利斯; GFL-230 恒温鼓风干燥箱购于天津莱伯特瑞公司; TSE320V 超 低 温 冰 箱 购 于 Thermo Scientific 公 司; S220-BiopH 计购于梅特勒公司。

1. 2 纤维素酶活力单位定义

1 mL 酶溶液在40 ℃、pH 4. 6 的条件下,1 min 从 底物中降解释放 1 mg 还原糖,即为 1 个酶活力单位 ( U/mL) 。

1. 3 葡萄糖标准曲线的绘制取

6 支具塞刻度试管,准 确 配 置 0、200、300、 400、500、600 mg /L 葡 萄 糖 溶 液,每 管 加 入 2 mL, 40 ℃水浴 5 min,分别加入 DNS 溶液 0. 50 mL,沸水 浴 5 min 后 冷 却,加蒸馏水定容至 10. 00 mL,于 540 nm处测量吸光度。

1. 4 纤维素酶活性测定

1. 4. 1 纤维素酶质量浓度的筛选

向 7 支试管内分别加入 0. 30 mL 羧甲基纤维素 钠溶液( 终浓度为 10. 00 g /L) ,再依次加入终浓度为 0. 16、0. 32、0. 48、0. 64、0. 80、0. 96 和 1. 12 g /L 的纤 维素酶溶液 0. 30 mL,pH 4. 6 的条件下,40 ℃ 水浴 25 min使羧甲基纤维素钠溶液与纤维素酶充分反应。 分别加入 DNS 溶液 0. 50 mL,沸水浴 5 min 后冷却, 加蒸馏水定容至 10. 00 mL。测定不同质量浓度的纤 维素酶与羧甲基纤维素钠溶液的反应关系,筛选最佳 的酶质量浓度进行下一步实验。

1. 4. 2 反应时间的筛选

向 5 支试管中分别加入质量浓度为 10. 00 g /L 的羧甲基纤维素钠溶液 0. 30 mL 以及“1. 4. 1”中筛 选出的适合质量浓度的纤维素酶 0. 30 mL,pH 4. 6 的 条件下,40 ℃水浴 5、10、15、20 和 25 min。分别加入 DNS 溶液0. 50 mL,沸水浴5 min 后冷却,加蒸馏水定 容至 10. 00 mL。观察不同反应时间对纤维素酶活性 的影响,筛选出纤维素酶的最适反应时间并进行下一 步实验。

1. 4. 3 羧甲基纤维素钠、纤维素酶以及齐墩果酸加样顺序的筛选

以“1. 4. 1”筛选的酶质量浓度以及“1. 4. 2”筛选 的反应时间为基础,将羧甲基纤维素钠、纤维素酶和 齐墩果酸按下列 3 种顺序加样( 纤维素酶与羧甲基 纤维素钠的体积为 0. 30 mL,齐墩果酸的体积 为 0. 30 mL,质量浓度为 1 mmol /L) : ①pH4. 6 的条件 下,分别将羧甲基纤维素钠、纤维素酶和齐墩果酸于 40 ℃水浴后一同加入到试管中反应; ②pH 4. 6 的条 件下,羧甲基纤维素钠和齐墩果酸混合后 40 ℃水浴, 再加入纤维素酶溶液进行反应; ③pH 4. 6 的条件下, 齐墩果酸和纤维素酶溶液混匀后 40 ℃ 水浴,再加入 羧甲基纤维素钠进行反应。反应结束后加入 DNS 溶 液 0. 50 mL,沸水浴 5 min,冷却后定容至 10. 00 mL。 在 540 nm 处测定溶液的吸光度值,比较 3 种加样方 式抑制效果,选出最佳加样顺序。

1. 4. 4 最优条件下齐墩果酸对纤维素酶的影响

取 5 支试管分别加入质量浓度为 1. 00 mmol /L的齐墩果酸溶液 0. 10、0. 15、0. 20、0. 25 和 0. 30 mL, 加蒸馏水至 0. 30 mL,按照“1. 4. 3”所得的最佳方法 添加羧甲基纤维素钠和纤维素酶各 0. 30 mL,pH 4. 6 的 条 件 下,40 ℃ 水 浴 5 min 后 加 入 DNS 溶 液 0. 50 mL,沸水浴 5 min,冷却后定容至 10. 00 mL, 540 nm 处测定各溶液的吸光度值。计算纤维素酶活 力及齐墩果酸对纤维素酶活力抑制率。

2 结果与分析

2. 1 葡萄糖标准曲线绘制

以浓度为横坐标( X) ,吸光度值为纵坐标( Y) , 绘制标准曲线,得回归方程为 Y = 0. 001X - 0. 004 4, R2 = 0. 995 4。随着葡萄糖浓度的增加,吸光度值逐 渐增加,还原糖在 200 ~ 600 mg /L 范围内线性关系良 好,可以用于酶活力测定。

2. 2 纤维素酶质量浓度对酶活力的影响

结果显示,在 0. 16 ~ 0. 80 g /L 范围内随着纤维 素酶质量浓度逐渐升高,酶活力逐渐增强。纤维素酶 质量浓度在 0. 16 ~ 0. 48 g /L 和 0. 64 ~ 0. 80 g /L 范围 内酶活力升高明显,在 0. 48 ~ 0. 64 g /L 范围内酶活 力升高平缓。纤维素酶质量浓度为 0. 80 g /L 时对底物的反应活力最高,选择该浓度为后续反应浓度。

2. 3 纤维素酶反应时间对酶活力的影响

结果显示,随着反应时间的延长,纤维素酶活力 逐渐降低。反应时间在 5 ~ 25 min 范围内纤维素酶 活力呈逐渐下降趋势。反应时间在 5 ~ 10 min 以及 20 ~ 25 min 范围内纤维素酶活力下降最快,反应时间 在 10 ~ 20 min 范围内纤维素酶活力下降缓慢。反应 时间为 5 min 时纤维素酶活力最高,可作为后续实验 反应时间。

2. 4 加样顺序对纤维素酶活力的影响

本研究考虑了 3 种加样方法,观察齐墩果酸对酶 活力的影响。结果显示,不同加样顺序对纤维素酶活 力有很大影响。羧甲基纤维素钠和齐墩果酸先加热, 再加入纤维素酶加样方法纤维素酶活力最低; 齐墩果 酸和纤维素酶先加热,再加入羧甲基纤维素钠的方法 纤维素酶活力最高; 羧甲基纤维素钠、纤维素酶和齐 墩果酸同时加入试管的方法纤维素酶活力介于前两 种方法之间。表明齐墩果酸对纤维素酶的抑制作用 是通过其与底物相互作用,进而阻碍了底物与酶的作 用,最终影响酶活性。齐墩果酸对酶和底物的作用也 不属于竞争性抑制作用。齐墩果酸与底物先预处理, 然后在与酶反应的方法对酶活力的抑制效果最佳,可 用于后续实验检测。此外,通过加样顺序的检测发 现,齐墩果酸对纤维素酶的抑制作用明显弱于其对底 物的抑制作用。

2. 5 最优条件下齐墩果酸对纤维素酶酶活力的影响

结果显示,随着质量浓度的升高,齐墩果酸对纤 维素酶活力的抑制率逐渐降低,在 0. 15 mmol /L 时纤 维素酶抑制率最低。当质量浓度从 0. 15 mmol /L 升 至 0. 30 mmol /L 时纤维素酶抑制率又逐渐上升。在 质量浓度为 0. 20 ~ 0. 30 mmol /L 范围内齐墩果酸对 纤维素酶有明显的抑制作用。齐墩果酸对纤维素酶 活力的抑制率的范围为 19. 4% ~ 82. 4% 。

3 结 论

纤维素酶质量浓度为 0. 80 g /L 时对底物的反应 活力最高; 反应时间为 5 min 时纤维素酶活力最高;以羧甲基纤维素钠和齐墩果酸先加热,再加入纤维素 酶这种加样顺序对酶活的抑制效果最佳。在质量浓 度为 0. 10 ~ 0. 30 mmol /L 范围内齐墩果酸对纤维素 酶有明显的抑制作用,但齐墩果酸对纤维素酶的抑制 作用为非竞争性抑制,即齐墩果酸是与酶活性中心以 外的基团结合,这种结合对酶活性的影响较小。本研 究表明,齐墩果酸不会影响纤维素酶的提取效率,可 以利用纤维素酶从天然植物中分离提取齐墩果酸。




 


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