青钱柳叶蛋白含量测定(KQ-500DE使用)

青钱柳又名一串钱、甜茶树或摇钱树，为胡桃科 植物青钱柳 Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinsk. 的落 叶乔木，是我国特有的珍稀濒危物种，具有“植物 界大熊猫”“医学界的第三棵树”称号。其叶具有甜 味，民间常以其为原料制备茶饮，具有生津止渴、 清热解暑、降血糖、降血压、调血脂等功效。青 钱柳叶含有黄酮、三萜及皂苷、多糖、无机元素和 氨基酸等化学成分，其所含黄酮、皂苷及多糖为主 要活性成分。本课题组前期谱效研究结果显示， 除了青钱柳叶所含总黄酮、总皂苷及多糖与其降血 糖作用具有相关性外，可能其他部位含有蛋白、氨 基酸等成分的也有一定的降血糖作用。植物蛋白具 有热量低、脂肪低及无胆固醇三大优点，可大大降 低高血压、高血脂、高胆固醇疾病发生的危险，具 有动物蛋白不可比拟的优势。

1 材料

1.1 仪器

Mulitiskan Go 全波长酶标仪，美国 Thermo Fisher；UV-1800 紫外分光光度计，岛津企业管理 （中国）有限公司；十万分之一电子天平，赛多利斯 科学仪器（北京）有限公司；昆山舒美KQ-500DE 型超声波清 洗仪，昆山市超声仪有限公司；Centrifuge 5810R 型 高速冷冻离心机，德国 eppendorf 艾本德。

1.2 试剂

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），阿 拉丁试剂上海有限公司；2，2’-联氮-二（3-乙基-苯 并噻唑- 6-磺酸）二铵盐（ABTS）、三吡啶基三嗪 （TPTZ），上海源叶生物科技有限公司；维生素 C （VitC），西陇化工股份有限公司；考马斯 G-250 （批号：EZ2811F373）、牛血清白蛋白（BSA）（批号： EZ28111E172）、α-葡萄糖苷酶、谷胱甘肽还原酶， 美国 Sigma 公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.3 药材

不同产地青钱柳叶共 25 批，由湖北中医 药大学中药资源与中药化学湖北省重点实验室叶晓 川 研 究 员 鉴 定 为 胡 桃 科 植 物 青 钱 柳 Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinsk. 的干燥叶。

2 方法与结果

2.1 青钱柳叶蛋白含量测定

2.1.1 标准品蛋白溶液的制备

取 BSA 3 mg，精密称定，置于 10 mL 容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即 得浓度为 0.305 mg·mL-1 的蛋白质标准溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备

取青钱柳叶粉（过 40 目 筛）1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入水 40 mL，超声提取 45 min，滤过，取续滤液备用。

2.1.3 标准曲线的绘制

按方法配制考马斯亮 蓝 G- 250 溶 液 。 分 别 取 0、 0.1、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、1.0 mL 牛血清白蛋白标准溶液于 10 mL EP 管 中，加水定容至 1 mL，摇匀；再分别从中取 0.5 mL 溶液加入考马斯亮蓝 G-250 溶液 5 mL，振荡，放 置 2 min。同法制备空白溶液，于 595 nm 下测定吸 光度（A）。以蛋白质浓度（C）为 X 轴，吸光度（A）为 Y 轴绘制标准曲线为 A=2.238 C+0.068 9（r=0.995 5）。 结果表明对照品 BSA 在 0.030 5～0.305 0 mg·mL-1 范 围内线性关系良好。

2.1.4 不同产地青钱柳叶蛋白的含量测定

取不同产 地共 25 批青钱柳叶，按 2.1.2 项下方法制备供试品 溶液，从中取 0.5 mL 溶液，其余按 2.1.3 项下条件操 作。以干燥品计算各样品中蛋白含量，结果见表 1。

2.2 青钱柳叶蛋白体外降血糖活性研究

2.2.1 青钱柳叶蛋白提取纯化

从表 1 可看出，产 地为江西省修水县黄坳山（6 月）的青钱柳叶，蛋白含 量（1.00%）适中，具有代表性，故选取黄坳山（6 月） 的青钱柳叶提取蛋白质进行体外降血糖及抗氧化活 性实验。称取黄坳山（6 月）青钱柳叶粉末 100 g，按 2.1.2 项下条件提取青钱柳叶蛋白质，得到蛋白质粗 提取液。往粗提液中加入硫酸铵至 80%饱和度，待 蛋白质完全沉淀，离心（12 000 r · min-1 ）15 min，取 沉淀，得较纯的蛋白质。用纯水溶解成蛋白质母 液。按 2.1.3 项下操作计算得该蛋白质母液的浓度。

2.2.2 对 α-葡萄糖苷酶的抑制作用

按方法配 制谷胱甘肽（GSH）溶液和 α-葡萄糖苷酶溶液。将获 得的青钱柳叶蛋白母液梯度稀释，得到浓度为 0.001 9、0.007 4、0.013 0、0.018 5、0.024 1、0.029 6 g·L-1 的供试品溶液，分别精密吸取 0.2 mL 置于 10 mL EP 管中，向各个 EP 管中依次加入 5 mL pH 为 6.8 的磷 酸二氢钾缓冲溶液、0.2 mL GSH 溶液和 0.4 mL α-葡 萄糖苷酶，摇匀，放置在 37 ℃水浴中 5 min，再向 各管加入 0.5 mL 的 4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷溶 液，摇匀，然后在 37 ℃水浴中放置 30 min。取各管 反应后的反应液各 2 mL，加入 4 mL 的 NaCO3 溶液 中终止反应。将终止反应后的溶液用紫外-可见分光 光度计在 400 nm 波长下测定吸光度。用未加 α-葡 萄糖苷酶的空白溶液调零。重复操作 3 次，取平均 值。计算该蛋白对 α-葡萄糖苷酶的抑制率。抑制率 （%）=（1-Ai/As ）×100%。As 为纯水对 α-葡萄糖苷酶作 用的吸光度，Ai 为供试品对 α-葡萄糖苷酶作用的吸 光度。以抑制率对浓度进行线性回归，得回归方程 为 Y=23.819X+0.123 8，r =0.998 9。计算青钱柳叶蛋 白的 IC50为 0.015 8 g · L-1 ，青钱柳叶蛋白对 α-葡萄 糖苷酶的抑制作用随浓度增加而增大，在 0.001 9～ 0.029 6 g · L-1 范围内量效关系明显，见图 1。

2.3 青钱柳叶蛋白体外抗氧化活性研究

用纯水对青钱柳 叶提取的蛋白质母液进行梯度稀释，得到浓度为 0.045 9、 0.091 8、0.137 8、0.183 7、0.229 6 g · L-1 的供试品 溶液。取 DPPH 适量，按配制 DPPH 醇溶液。 取 10 μL 上述供试品试液和 200 μL 的 DPPH 溶液， 先后加入 96 孔板中，于暗处反应 30 min 后用酶标仪 在 517 nm 处测定吸收波长，VitC 为阳性对照。重复操作 3 次，取平均值。计算该蛋白对 DPPH 自由基 的清除率，清除率（%）=（1-Ai /As ）×100%。As为纯水对 DPPH 作用的吸光度，Ai为供试品对 DPPH 作用的吸 光度。以抑制率对浓度进行线性回归，计算得青钱 柳叶蛋白和 VitC 的 IC50 值。


3 讨论

青钱柳乃珍稀树种，仅存于中国，野生多以零星 分布，资源很少，目前主要依靠人工种植。本研究 采集了青钱柳主要产区的 25 批样品，青钱柳叶蛋白 含量范围为 0.58%～1.39%。研究结果显示，产于贵 州的青钱柳叶蛋白含量普遍较低，产于江西修水地 区的则相对均较高，而同一产地不同采收期药材蛋 白的含量差异较小，推测自然地理位置是影响青钱 柳叶蛋白含量的主要因素。



 

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