TMA核酸检测的影响

血液病毒核酸检测（nucleic acid testing，NAT） 直接检测病毒核酸，与酶联免疫吸附法(ELISA)相 比能缩短血液病毒检测的窗口期， 更好地保障血 液安全， 已成为许多国家血液筛查病毒的必要手 段，目前我国也已全面开展血液病毒核酸检测。标本采集、处理、保存等因素对保证 NAT 检测结 果的准确性尤为重要。 若标本采集、处理不当可 能导致溶血，血浆中 Hb 可能会影响血液病毒核酸检测的有效性和准确性。

收集重庆市血液中心 2017 年 5 月-2017 年 7 月经体检和血液初筛检验合格 的无偿献血标本 500 份，分别用含分离胶的“非可 替”抗凝真空管（含 EDTA-K2 喷雾干粉）采集 6~ 8ml 全血用于 NAT 检测；“BD”抗凝真空采血管（含 EDTA-K2 喷雾干粉） 采集 4~5ml 全血用于 ELISA 检测。 采集后的标本管置于 4℃保存，在采集 4~6h 内 2000g 离心 15min，检测前置于 4℃保存，分别进 行 ELISA 和 NAT。 挑选 ELISA 和 NAT 均为非反应 性的标本，封口胶密封后 4℃保存，1 周内使用。 本 研究方案获得重庆市血液中心伦理委员会的批 准。

TEKEN RSP150/200 型全自动加样 仪（瑞士 TEKEN 公司）和 FAME 2420/30 全自动酶 免 分 析 仪 （ 瑞 士 HAMILTON 公 司 ）、Procleix TIGRIS 全自动核酸检测分析系统 （西班牙盖立复 公司）及配套的 PRI(试剂准备温育器，美国 Chiron 公司)、M-series AD 血细胞分析仪（瑞典 MEDONIC 公司）、RT3100 洗板机 （深圳雷杜公司）、EXL808 酶标仪（美国 BIO-TEK 公司）、L535R 离心机（湖南湘仪公司）、KQ218 超声波清洗器 （江苏昆山市超声波仪器有限公司）。

乙型肝炎病毒表面抗原诊 断试剂：北京万泰、英国索林；丙型肝炎病毒抗体 诊断试剂：北京万泰、美国强生；HIV（1+2）P24 抗 原及抗体诊断试剂：法国伯乐，HIV 抗体诊断试剂： 上海科华。

乙型肝炎病毒、 丙型肝炎病 毒、人类免疫缺陷 病 毒（1 型）NAT 试剂 盒（TMA化学发光法）”（Procleix Ultrio Plus Assay）， 美国Hologic 公司。 该试剂可同时定性检测人类血浆中 的 HIV-1 RNA、HCV RNA 和 HBV DNA， 试剂盒 内含有配套的 Procleix Plus HIV-1/HBV/HCV 鉴别 试剂。

HIV、HCV、HBV 的血浆病毒质 控品（北京万泰公司），均为有证标准物质，浓度分 别为：HIV 200IU/ml、HCV 30IU/ml、HBV 30IU/ml。

根据所用检 测试剂说明书和参考类似研究，我们将本研 究的溶血程度分为 5 个梯度，血浆 Hb 浓度从低到 高依次为 0g/L（肉眼观察无溶血）、5g/L、10g/L、20g/ L、40g/L。 因病毒载量过低时易出现检测阴性，将难 以判定是溶血导致假阴性还是低病毒载量下检出 率较低的影响， 所以本研究根据试剂说明书的检 测下限和有关核酸检测质控品浓度设置的研究报 道，将病毒浓载量分为 2 个水平，低水平组：HIV 20IU/ml、HCV 10IU/ml、HBV 5IU/ml； 高 水 平 组 ： HIV 60IU/ml、HCV 20IU/ml、HBV 15IU/ml。

模型 将商品化的 HIV、HCV、HBV 核酸检测血浆 病毒质控品作为病毒标准品， 进行稀释建立梯度 病毒载量的标本。 为避免基质效应，采用 NAT 和 ELISA 检测均合格的无溶血血浆作为稀释液，按实 验设计的病毒载量水平对标准品进行稀释。

取 NAT 和 ELISA 检测均 合格的核酸标本管中压积红细胞， 与等量去离子 水混匀后使用超声波破碎红细胞， 具体的超声波 破碎红细胞装置， 采用去离子水煮沸 冷却后制得的脱气水作为声传导介质。 具体操作 流程如下：超声波作用 5min→颠倒混匀 10 次→超 声波再次作用 5min→颠倒混匀 10 次→2000g 离心 15min→转移上半部分液体到洁净试管，作为溶血 标本原液，血细胞分析仪检测其 Hb 浓度。 用血细 胞分析仪测量离心后的溶血血浆 Hb 浓度，与已 知病毒载量的标准品混合， 通过经检验合格的无 溶血血浆调节含病毒的溶血标本体积， 配制成按 实验设计的Hb 浓度和病毒载量。 溶血程度 Hb 为 40g/L 时的具体配比见表 1， 其余 Hb 梯度浓度的 配比按照设定的浓度计算，进行配制。

根据试剂说明书， 每 次 NAT 检测需 500μl 样本，为确保样本量的充足，本量水平组， 每种病毒 1 个， 用作研究测试的质控 管；在每批次测试时，对每个 Hb 的梯度浓度级别， 均配制 1 个不含病毒的对照管， 因此每批的测试 标本数为 80 个。 具体核酸检测操作参见相关核酸 检测研究文章。

本研究所建立的 Hb 梯 度浓度溶血模型中的 Hb 浓度，均在 95%的置信区 间范围内，P 值均大于 α，因此，每个 Hb 梯度内各 标本管的 Hb 浓度比较差异无统计学意义。

本研究 3 个测试批次，每批次 80 个， 共计 240 个测试标本。 Hb 分别为 0g/L、5g/ L、10g/L、20g/L、40g/L 的梯度浓度， 病毒载量分别 是 高 水 平 组 ：HIV 60IU/ml、HCV 20IU/ml、HBV 15IU/ml， 低 水 平 组 ：HIV 20IU/ml、HCV 10IU/ml、 HBV 5IU/ml，共 225 个测试标本，均呈反应性。 对 照管（未加病毒的测试标本）均呈非反应性。

目前在研究溶血对核酸检测影响的报道中，采用的溶血方式多为反复冻融、机械破坏等， 这些方法耗时较长，虽能将红细胞膜破坏，但也容 易导致 Hb 的变性。 在本研究中，利用超声波的机 械效应、空化效应破碎红细胞致红细胞溶血，建立 溶血模型， 操作时间较短， 可提高研究实验的效 率。 超声波致红细胞溶解的最佳条件需要的声强 不高，因此利用超声波清洗仪的超声波能量，即 可对红细胞进行破坏释放出其内的血红蛋白，制 得溶血标本。 为保证超声波的传导效果，减少超声 波由于空化机制在超声波清洗仪容器内液体中传 导的能量耗损， 我们将去离子水通过煮沸后冷却 的方式制成脱气水，作为声波传导介质，比单用 普通去离子水更利于声能传导， 进一步提高了细 胞破碎效率。 而在制备溶血标本原液时，由于超声 波在全血中的声能衰减比水中大， 为了减少不必 要的声衰减，提高超声破碎细胞的效能，同时为了 避免完全用压积红细胞破碎后形成的溶血标本粘 度大而难以定量吸取的问题， 采用等量去离子水 稀释混匀红细胞后再用超声波破碎。 充分破碎红 细胞后离心，红细胞碎片沉降到底部，但离心后标 本溶血程度较重， 难以肉眼分辨细胞碎片和上层 液体的分界线， 为尽量避免在吸取溶血标本原液 时吸入红细胞碎片， 只吸取离心后的上半部分液 体。