昆山超声仪器在高效液相色谱法测定中的使用

科舒筋洗剂在本院沿用有近 20 年 , 是本院制剂中的 拳头制剂。该制剂疗效确切 , 广泛用于临床 , 使用量逐年增 长 , 得到临床和患者高度的认可 , 临床主要用于跌打损伤、 劳损、腰颈椎病、骨关节炎以及骨折恢复期等的外洗、熏蒸 治疗。其主要由两面针、苏木、黄柏、荆芥、 钩藤、透骨 草、威灵仙、千年健、 北刘寄奴、宽筋藤 10 味中药组成 , 具 有活血散瘀、舒筋通络作用 , 常用来治疗跌打损伤、瘀血等。 该制剂现行标准仅对苏木、黄柏进行定性鉴别, 对于其含 量检测目前尚无标准 , 导致无法全面有效地控制外科舒筋洗 剂的质量。黄柏在外科舒筋洗剂处方中为臣药 , 盐酸小檗碱 为黄柏主要有效成分, 故本文拟探索采用高效液相色谱法 建立该制剂中盐酸小檗碱的含量测定方法 , 并测定外科舒筋 洗剂中盐酸小檗碱的含量, 旨在为控制其质量标准提供 客观定量的评价方法 , 提高该制剂质量标准 , 为日常生产提 供检验依据 , 现具体报告如下。

美国安捷伦公司 Agilent-1200 型高效液相色谱 仪 , 包括安捷伦四元泵 , 安捷伦在线脱气机 , 安捷伦紫外检测 器等 ；安捷伦色谱柱 ( 型号 ：Eclipse Plus 填料 ：C18) ；德国赛多利斯公司电子天平 , 昆山超声仪器有限公司 KQ-250DA 型数控型超声波清洗器 ( 功率 250 W, 频率 40 kHz)。

乙腈 ( 色谱纯 , TEDIA), 磷酸二氢钾 ( 广州化学 试剂厂 20170701-1), 水为超纯水 ；盐酸小檗碱对照品 ( 批号：110713-2011814 供含量测定用 ) 购自中国药品生物制品检定 所 , 含量为 86.7%；外科舒筋洗剂 ( 河源市中医院提供 3 批次： 批号 ：181001、181002、181101)。

对照样品溶液的配制 ：以电子分析天平称取盐酸小檗碱对照品 10.02 mg 于 100 ml 量瓶中 , 然 后加甲醇溶液将其溶解并稀释至刻度 , 作为贮备液 , 精密量 取贮备液 5 ml 于 25 ml 量瓶中 , 同样以甲醇溶液稀释至刻度 后即为对照样品液 ；供试品溶液的配制 ：取外科舒筋洗剂溶液过滤后 , 精密量取 20 ml, 蒸干 , 加甲醇溶液使其溶解 ( 必 要时可用超声方法溶解 ) 并转移至 50 ml 量瓶中 , 加甲醇溶 液至刻度 , 即得供试品溶液 ；阴性对照品溶液液的配制 ：按 质量标准中规定的处方比例同法配制不含黄柏的阴性样品 , 按供试品溶液配制方法配制成相应的阴性对照品溶液。

以 Agilent Eclipse Plus C18 (250.0 mm×4.6 mm, 5 μm) 为填充柱 , 流动相为乙腈 -0.03 mol/L 磷 酸 二 氢 钾 溶 液 (28∶72), 检测波长为 347 nm, 流速为1.0 ml/min, 进样量为 10 μl ；以峰面积外标法定量。在本色谱 条件下 , 外科舒筋洗剂中盐酸小檗碱对照品的色谱峰与其他 组分峰均取得较好分离 , 干扰性较小。

分别取对照品溶液、样品溶液、阴性 对照液 , 按上述色谱条件进样测绘高效液相色谱法图谱 , 组 分的出峰时间区域相互分离 , 未发现明显干扰峰 , 结果表明 处方中其他成分及辅料对盐酸小檗碱的测定无干扰作用。见 图 1。

2. 4 线性关系的考察　

分别精密量取盐酸小檗碱对照品储备液 1、3、5、7、9、11 ml, 置 于 25 ml 量 瓶 中 , 通 过甲醇定容至要求刻度 , 充分摇匀后得到一系列标准溶 液。 按 上 述 色 谱 条 件 分 别 进 样 10 μl, 测 定 峰 面 积 , 以 峰 面积 (A) 为纵坐标 , 盐酸小檗碱对照品浓度 (C) 为横坐标 绘制标准曲线 , 进行线性回归 , 计算得回归方程。盐酸小 檗 碱 A=29.63C+45.743(r=0.9912), 结果表明盐酸小檗碱在 3.4749~38.2243 μg 范围内与峰面积线性关系良好。

外科舒筋洗剂为本院院内制剂 , 具 有活血散瘀、舒筋通络之功效 , 临床用来治疗跌打损伤、瘀 血等疾病 , 临床应用多年 , 效果显著。外科舒筋洗剂原标准 仅对苏木、黄柏进行定性鉴别 , 不符合质量标准提升要求 , 对其日常生产质量也难于监控。本试验曾经尝试对两面针中 氯化两面针碱进行含量测定 , 但供试品峰面积偏小 , 考虑 现有工艺中该成分提取率不高, 故不再选择两面针作为研 究对象。黄柏在该制剂处方中为臣药 , 其具有清热、消肿、 止痛等作用 , 与两面针等其他药发挥活血散瘀、舒筋通络止 痛之功效。黄柏主要以盐酸小檗碱为主要有效成分。在 上述试验条件下 , 经试验证实 , 盐酸盐酸小檗碱试验分离度 和重复性较好 , 且阴性无干扰 , 故选择其为研究对象。

经在线全波长紫外吸收光谱扫描分 析 , 盐酸小檗碱在 265 nm 和 347 nm 波长处有最大吸收波长。 若采用 265 nm 作为检测波长时 , 盐酸小檗碱的分离效果较差 , 分离度达不到要求；而采用 347 nm 作为检测波长时 , 盐酸小檗碱的分离度好 , 峰形良好。且其他物质对测定无干 扰。最终采用 347 nm 作为检测波长。

提取方法可选取甲醇、甲醇 - 盐酸 (100∶1) 两种溶剂分别进行提取 , 结果并无明显差别 , 但从 操作方法的简便方面考虑 , 选取甲醇提取盐酸小檗碱。

作者曾对不同流动相体系条件的实验 效果分别进行了考察 , 分别比较乙腈 -0.1% 磷酸溶液 ( 每 100 ml 加十二烷基磺酸钠 0.1 g) 及乙腈 -0.03 mol/L 磷酸二氢钾溶液为流动相的效果 , 结果表明 , 两者结果并无明显 差别 , 从操作方法的简便及环境保护方面考虑 , 选取乙腈 -0.03 mol/L 磷酸二氢钾溶液作为流动相。

通过对不同时间生产 3 批 外科舒筋洗剂进行盐酸小檗碱含量的测定 , 结果显示差异 小 , 说明该制剂生产工艺稳定 , 在制订内控标准或者提高 该制剂标准 , 可暂定外科舒筋洗剂的黄柏以盐酸小檗碱计 , ≥30 μg /ml。

综上所述 , 本研究建立测定外科舒筋洗剂中盐酸小檗碱 含量方法 , 经过方法学验证 , 所建立的测定方法符合定量分 析要求 , 最终确定以 347 nm 为检测波长 , 甲醇为提取液 , 乙 腈 -0.03 mol/L 磷酸二氢钾溶液为流动相 , 测定结果显示该法 简便、准确、快速、分离度好 , 重复性好 , 干扰小 , 可用于 外科舒筋洗剂的质量控制。