测定定山楂异槲皮苷和金丝桃苷

中药山楂是蔷薇科，属植物山楂（Crataegus Pinnatifida Bge）的干燥果实，在国内多省区广泛分布。 研究发现，其具有助消化、降脂、抗氧化、抗心律失常、 抗炎和防治动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝等作用，山楂果肉中含有黄酮类、有机酸、三萜类等成分 ， 因其营养及药用价值高，在食品、保健食品和药品等 领域应用十分广泛 ，常用的规格有净品、炒品、焦品与炭品等。

研究表明，黄酮类化合物在对心血管的保护作用中 具有突出的生理活性和药理作用 。异槲皮苷和金丝 桃苷存在于多种植物体内，属于黄酮醇苷类化合物， 具有抗氧化、抗炎等药理作用，是山楂特征性成分。 《中华人民共和国药典》2015 版认为山楂以枸橼酸 为含量测定指标，专属性不强，因此为了科学有效地 评价山楂质量，有必要建立测定其特异性成分异槲皮 苷和金丝桃苷的方法。

多功能高速粉碎机（型号：BO100T，永康市铂欧五金制品有限公司）；电子天平（型 号：AR224CN，奥豪斯仪器有限公司）；数控超声清洗器（型号：KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司）； 1260 高效液相色谱仪（Aglient/ 安捷伦）；一体化超纯 水机（型号：MILLI-QDirect16，美国 Millipore 公司）。 1.2 材料 山楂饮片（产品批号：1601202，产地：山 东）；新鲜山楂（超市购买）；金丝桃苷（产品批号： B21194，上海源叶生物科技有限公司）；异槲皮苷（产 品批号：111809-201403，中国食品药品检定研究院）； 甲醇、甲酸、乙腈均为色谱纯（默克化工技术有限公司）； 试验用水皆为实验室自制二次蒸馏水。

色谱柱：Ultimate@XB-C18（4.6× 250 nm，5 μm），流动相洗脱条件，见表 1；流速： 1 mL/min；检测波长：360 nm；柱温：30℃；进样量： 10 μL。

1.3.2 对照溶液的配制

精密称取金丝桃苷、异槲 皮苷对照品 20 mg 于 50 mL 容量瓶中，加甲醇适量 超声溶解后用甲醇定容，制得对照品储备液。精密 量取 1 mL 金丝桃苷和异槲皮苷对照品储备液于 10 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得对照品混合液溶液。 1.3.3 供试品溶液的配制 精密称取山楂样品粉末 1 g， 置于 25 mL 锥形瓶中，加 10 mL60% 乙醇，称定重量， 超声提取 2 次，30 min/ 次，合并提取液，提取温度为 60℃，功率 80%，冷却，再称定重量，用 60% 乙醇补 足减失重，摇匀后静置片刻，取上清液，并以 0.45 μm滤膜滤过，即得供试品溶液。

袁丽春等 以 HPLC 法测定不同市售荷叶药材中 金丝桃苷和异槲皮苷的含量，发现其含量变化较大 , 认为应纳入荷叶药材的质量控制标准以更全面反映荷 叶药材质量。在测定罗布麻叶中芦丁、金 丝桃苷、异槲皮苷含量时，发现温度对金丝桃苷和异 槲皮苷的色谱峰分离有明显改善作用。林忠宁等 的试验发现金丝桃苷和异槲皮苷均属黄酮类，分子结 构相似，存在酚羟基而呈弱酸性，在流动相中加入适 量酸可以抑制解离，改善色谱峰拖尾现象，缩短分析 时间。山楂是减肥降脂类保健食品的常用原料，但《中 华人民共和国药典》2015 版“山楂”项下所收录的 含量测定仅以枸橼酸计，不能全面反映山楂成分与含 量。本试验考察了流动相比例、检测波长等条件，首 次建立了 HPLC 同时测定山楂中金丝桃苷和异槲皮苷 含量的方法。 2.1 提取方法的考察 本试验考察了回流提取和超声 提取两种方法提取山楂中异槲皮苷和金丝桃苷。

两法提取的异槲皮苷和金丝 桃苷含量相近，两法提取的金丝桃苷成分含量相近， 但回流提取法对异槲皮苷的提取效率较低且杂峰多， 而超声提取法对两种成分的提取效率高且方便易行， 故本试验选用超声提取法。

本试验比较了不同浓度的甲醇 （20%、40%、60%、80%）和不同浓度的乙醇（10%、 20%、40%、60%、80%）进行超声提取，发现乙醇提 取的异槲皮苷和金丝桃苷含量远高于甲醇提取的含量。 且在40%～60%范围内，当乙醇浓度越高，提取率越大， 因此选择 60% 的乙醇作为异槲皮苷和金丝桃苷的提取 溶剂。

提取温度是影响提取效率的重 要因素之一，本研究考察了30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃。 结果表明，在 60 ℃时提取的异槲皮苷和金丝桃苷的色 谱峰面积最大，且在此温度时出峰情况良好，因此选 用 60 ℃为此次试验的提取温度。

采用超声提取的方法提取山 楂中黄酮类成分，超声波处理时间由 10 min 延长到 30 min 时金丝桃苷和异槲皮苷提取率迅速升高，再 延长则提取率下降。为提高黄酮类成分的提取率， 将供试品超声提取2次，30 min/次，合并2次提取液， 发现较超声提取 1 次的效率更高，但是超声 3 次合并提取液的提取效率较超声 1 次和 2 次提取的效率 都差，所以本次试验采用将供试品超声提取 2 次， 30 min/ 次的提取方法。

分别精密吸取 对照品溶液、供试品溶液 10 μL 注入高效液相色谱仪， 记录色谱图。对照品混合溶液测定结果。精密吸取混合标准品储备液 1 mL 于 10 mL 量瓶中，甲醇定容，依次对半稀释的 9 组不同 浓度的对照品混合液，编号为序号 1 ～ 9。进样量为 10 μL，按照 1.3.1 的液相色谱条件进行测定。以对照 品的浓度（C，μg/mL）为横坐标（X），液相色谱峰 的平均峰面积（A，mAU）为纵坐标（Y），绘制标准 曲线，得到回归方程和相关系数。取母液稀释 10 倍混合对照品溶液（异 槲皮苷、金丝桃苷的浓度分别是 38.56、38.52 μg/mL） 10 μL，进行测定。一天内连续进样 6 次，记录峰面积。 结果异槲皮苷、金丝桃苷峰面积的 RSD 分别为 0.46%、 0.53%，表明仪器精密度良好。

本试验采用 HPLC 法同时测定山楂中异槲皮苷和 金丝桃苷，结果表明该方法的精密度、稳定性和线性 关系均满足分析检测的要求。在同一色谱条件下，同 时测定异槲皮苷和金丝桃苷的含量，方法简单高效、 准确稳定，结果较为满意。结果表明，市购新鲜山楂 中异槲皮苷和金丝桃苷的含量较药店购买的山楂饮片 中异槲皮苷和金丝桃苷的含量较低，说明产地不同等 因素影响了异槲皮苷和金丝桃苷的含量，具体原因将 继续深入研究。