不同种属肝微粒体中的代谢差异分析-KQ-5200DE使用

树豆酮酸A是从豆科植物树豆[Cajanus cajan（Linn.）Millsp.]叶中 分离出的一种新的菧类化合物。已有体内外研究证 实，CAA作为肥胖症特异性靶点蛋白酪氨酸磷酸酶1B （PTP1B）抑制剂，可明显提高胰岛素抵抗脂肪细胞对葡 萄糖的吸收量，并可降低先天肥胖型小鼠的体质量和空 腹血糖水平、提高其葡萄糖耐受量，具有开发成糖尿病 治疗药物的潜力和价值。

1 材料

1.1 仪器

UltiMate 3000 型 UPLC-TSQ Endura 型三重四极杆 串联质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）和Xcalibur v2.2数 据处理系统（美国Thermo Finnigan公司）；JN300-2型氮 气吹扫仪（苏州吉米诺仪器有限公司）；X1型高速离心 机（香港基因有限公司）；KQ5200DE型超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）；FA805N型十万分之一电子 天平（上海菁海仪器有限公司）；DW-86L486型超低温保 存箱（青岛海尔股份有限公司）。

1.2 药品与试剂

CAA对照品（贵州医科大学药物化学重点实验室制备，批号：20180521，纯度：＞98％）；染料木素对照品（内 标，批号：528C021，纯度：＞98％）、烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸磷酸二钠（NADP-Na2，批号：718B0225）、葡萄糖-6-磷 酸-二钠（G-6-P-Na2，批号：116B039）、葡萄糖-6-磷酸脱 氢酶（G-6-P-DH，批号：20160725）均购自北京索莱宝科 技有限公司；雄性 SD 大鼠肝微粒体（批号：M10017. 2017002）、雄 性 比 格 犬 肝 微 粒 体（批 号 ：M10007. 2017002）、人肝微粒体（男性健康蒙古利亚人种，批号： M10001.2017003）均购自武汉普莱特生物医药技术有限 公司，质量浓度均为20 g/L（以蛋白计）；甲酸、甲醇、乙腈 均为色谱纯，氯化镁、柠檬酸钠等其余试剂均为分析纯， 水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 CAA 和内标溶液

精密称取CAA 对照品适量， 用甲醇溶解并定容，制得质量浓度为1 mg/L的CAA贮 备液；同法制得质量浓度为1 mg/L的内标贮备液；上述 贮备液均置于4 ℃保存，备用。临用前，将CAA贮备液 与适量甲醇、0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4；下 同）、肝微粒体、辅酶溶液等混合，制备孵育体系；将内标 贮备液用甲醇稀释，制得质量浓度为 2 μg/mL 的内标 溶液。

2.1.2 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）辅酶溶液

A 液：依次加入 NADP-Na2、G-6-P-Na2、氯化镁 200、200、133 mg，用水定容至10 mL。B液：依次加入柠 檬酸钠、G-6-P-DH 44 mg、1 000 U，用水定容至 25 mL。 将A、B液均置于－20 ℃保存，备用。临用前，将A、B液 按体积比 5 ∶ 1 混合，制得浓度为 1 mmol/L（按反应产物 NADPH计）的辅酶溶液。

2.2 样品孵育与处理

2.2.1 孵育体系的建立

取大鼠、比格犬、人肝微粒体 各适量，用 PBS 稀释至 0.5 g/L，随后加入“2.1.1”项下 CAA贮备液适量，使CAA最终质量浓度为5 μg/mL，同 时确保孵育体系中甲醇的含量不超过1％。将上述溶液 置 于 37 ℃ 水 浴 中 静 置 5 min 后 ，加 入“2.1.2”项 下 NADPH 辅酶溶液以启动反应。该体系总体积为 200 μL，其中NADPH的终浓度为1 mmol/L，有机溶剂不超过 5％。

2.2.2 样品孵育与处理

将上述孵育体系继续置于37 ℃水浴中进行孵育，分别于孵育 0、5、10、15、30、45、 60 min时，加入含内标（2 μg/mL）的乙腈400 μL终止反 应，涡旋混匀30 s，于4 ℃下以16 000×g离心10 min，取 上清液以氮气流吹干，残渣用甲醇 200 μL 复溶，再以 16 000×g离心10 min，取上清液适量进行UPLC-MS/MS 分析，考察各时间点待测物的含量。各孵育体系均平 行操作3次。

3 讨论

肝脏是代谢的主要器官，是药物进行生物转化的重 要场所。在这个复杂的生理过程中，药物被各种代谢酶 分解、转化成不同的分子（即代谢物）以发挥其药理活 性。与体内代谢研究相比，体外代谢研究具有成本低 廉，操作方法简便、快速，结果重现性好等优点，适用于 新药研发候选化合物代谢行为的早期研究及筛选。 为此，本研究对 CAA 在不同种属肝微粒体中的代谢行 为进行了初步探讨。