KQ-100使用于红花基因克隆及表达分析

WD40 是真核生物中普遍存在的一个超基因转 录因子家族，它们在结构上包一个或几个高度保守 的 WD 型结构域，也因此被称为 WD40 重复蛋白 （WDR）。最初 WD40 转录因子被认为是 G 蛋白 β 亚基受体，该结构域包括 43 个氨基酸残基，N 末端 为甘氨酸-组氨酸二肽（GH）结构，C 末端为典型 的色氨酸-天冬氨酸二肽结构（WD），携带该基序的蛋白称为 WD40 蛋白。

本研究使用的“吉红一号”红花品种购自新疆塔 城，由吉林农业大学生物反应器工程中心保存，并种 植于人工气候室，待进入花期后，分别于花蕾期、初 花期、盛花期、衰落期时间点收集花瓣组织，以花蕾 期花瓣作为对照，同时收集根、茎、叶材料进行组织 特异性表达分析。全部材料均液氮速冻，至于−80 ℃ 超低温冰箱内长期保存。对照品羟基红花黄色素 A （hydroxysafflor yellow A，HSYA），批号111637-200905， 购自森贝伽有限公司，质量分数大于 98%。

Invitrogen TRIzol 试剂（赛默飞世尔有限公司）； PrimerScript RT reagent kit 试剂盒、SYBR Advantage qPCR premix 试剂盒（宝生物工程有限公司）；T-easy 载体（全式金生物有限公司）；KQ-100 型超声波仪器 （昆山舒美有限公司）。

将收集红花花瓣等组织液氮内充分研磨，取 100 mg 植物材料置于无 RNA 酶 的 1.5 mL Eppendorf 离心管内，使用 Invitrogen TRIzol 试剂并 参照说明书进行总 RNA 提取。将获得的总 RNA 用 DEPC 水溶解，NanoDrop2000 测定 260 nm 下总 RNA浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性。

利用 PrimerScript RT reagent kit 试剂盒将红花 盛花期花瓣组织总 RNA 逆转录成 cDNA。根据红 花花瓣转录组数据（SRA 数据库登录号 047279.2） 中 WD40 候选基因为参照，根据 CDS 序列设计合 成引物序列分别为上游：（5’-ATGCCAAACACGCTCGTCATAG-3’）和下游：（5’-TCATTCACCGTCGTCAGATACA-3’），产物长度为 1 053 bp。PCR 扩 增条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，循环 35 次，最后 72 ℃、5 min。将扩增的 DNA 片段克隆到 T-easy 载体上，挑选阳性克隆进行测序。

CtWD40 基因序列测序后去除载 体序列，提交 NCBI 数据库进行 BLASTN 和 BLASTX 比对分析，搜索同源核酸序列及蛋白质序 列。使用 DNAMAN、Swiss-Model 工具进行蛋白结 构域及高级结构预测分析。

根据CtWD40 基因克隆测序 结果，推测编码氨基酸序列，使用 GenBank BLASTX 利用 Nr 数据库进行比对分析，搜索相似 度较高的不同物种WD40蛋白序列，利用MEGA 6.0 进行氨基酸序列进化分析，使用邻接法 （neighbor-joining，NJ）构建系统进化树。

为研究CtWD40 基因在红花不同组织中的表达 模式，以 18 S rRNA 为内参基因，利用实时荧光定 量 PCR 技术分别检测 CtWD40 在根、茎、叶片、 花蕾期花瓣、初花期花瓣、盛花期花瓣、衰落期花 瓣中转录水平差异。按“2.1”项方法提取上述材料 总 RNA 后，使用 PrimerScript RT reagent kit 试剂盒 合成 cDNA；使用 SYBR Advantage qPCR premix 试 剂盒对基因进行表达分析鉴定。CtWD40 荧光定量 PCR 基因引物分别为上游： 5’-TCGTTTGAGCCCGGTATTGTTA-3’；下游：5’-TGCAAGAGAGAGAAGGCCAA-3’。18 S rRNA 荧光定量 PCR 基因引物分别为上游：5’-GAGAAACGGCTACCACATCCAA-3’和下游：5’-TCGTTTGAGCCCGGTATTGTTA-3’，扩增产物长度为 120 bp，生物学重复 次数为 3 次。使用 Mx3000 荧光定量 PCR 仪器（罗 氏）进行扩增，反应条件如下：使用 2 步法，95 ℃ 预变性 5 min；95 ℃变性 5 s，60 ℃退火延伸 30 s， 循环 40 次。

通过 PCR 方法扩增获得长度为 1 053 bp 的 CtWD40 基因片段。测序结果表明获得的 cDNA 片段具有 1 个完整的编码框，可编码 350 个氨基酸残基。使用 DNA MAN 软件对红花 CtWD40 等8个WD40氨基酸序列进行多重氨基酸序列比对分 析，结果鉴定到 8 个位于 WD 结构域位于 WD40 氨 基酸保守区序列内部（图3）。氨基酸残基长度分布2～ 9 个，氨基酸序列结构特征为 WD 或 W（X）nD。同源模建法分析 CtWD40 蛋白高级结构，结果发现该蛋 白质具有明显的主链和环区结构。氨基酸序列相似性分析在蛋白进化研究中至 关重要。为研究红花 WD40 转录因子的进化关系， 利用 MEGA 6.0 软件使用 NJ 法对红花、山杏、草 莓、马铃薯等共 19 个 WD40 蛋白序列进行系统发 育分析，系统进化树构建结果。研究结果发 现，蛋白亲缘关系较近的种属在进化树上距离最 近。红花、向日葵、莴笋 3 个 WD40 转录因子聚在 同一个进化枝上，具有较近亲缘关系。红花、向日 葵、莴笋均为菊科植物，红花 WD40 与莴笋 WD40 亲缘关系最近。此外，茄科植物烟草、马铃薯、番 茄、潘那利番茄 WD40 转录因子集中分布在另一个 进化枝上，说明其亲缘关系较近。HSYA 在不同时间花瓣中含量呈现先升高后 降低趋势，盛花期花瓣中质量分数最高， 为（47.59±0.01）mg/g，在花蕾期、初花期及衰落 期质量分数分别为（28.48±0.01）、（38.16±0.01）、 （28.74±0.01）mg/g。分析 CtWD40 基因表达水平与 HSYA 含量的相关性，皮尔森相关系数为 0.936（P＝ 0.020），说明 CtWD40 在红花不同花期花瓣中基因表达 水平与HSYA 量具有相关性。

作为植物中广泛存在的超转录因子家族，WD40 转录因子家族成员在拟南芥、水稻、谷类中的陆续发 现揭示了其在植物中功能调控的多样性。WD40 转录 因子通过介导蛋白质相互作用的方式参与一系列生 物过程，包括次生代谢化合物合成、植物器官形态建 设、组织分化等。尤其在黄酮代谢途径研究中，多项 研究结果均揭示 WD40 转录因子与 MYB、bHLH 互 作后调控黄酮及类黄酮化合物的生物合成过程。本研 究首次克隆并鉴定了红花 CtWD40 转录因子基因，该 转录因子具有 8 个典型的 WD 保守结构域，确保了 WD40 蛋白在生物过程中的功能行使。

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