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昆山舒美浅谈加参片提取物入血成分

返回列表 来源:未知 发布日期:2019-09-16 08:54【

慢性心力衰竭( chronic congestive heart failure,CHF) 是 大多数心血管疾病的最后归宿和死亡原因,发病率也逐年 上升,我国已达 0. 9% ,老年人群的发病率达 1. 3%。 且老年心力衰竭患者的住院时间长,再入院率高,生活质量 差。虽然 CHF 的住院率占同期心血管病的 20% ,但死亡率 却占 40%,提示其预后的严重性,情况不容忽视。加参 片处方来源于临床经验方。

1 仪器与材料

1. 1 仪器

超高效液相色谱系统 ACQUITY UPLC ( 美国 Waters 公 司) ,PDA 检 测 器 ( 美 国 Waters 公 司) ,Waters Q - TOFPremier 质谱仪( 英国 Waters MS Technologies 公司) ,数据 处理软件为 MasslynxTM4. 1 和 Metabolynx( 美国 Waters 公 司) ; Mettler Toledo XS205 分析天平( 瑞士 Mettler Toledo 公 司) ; KQ-500DE 型数控超声波清洗仪( 昆山舒美超声仪器有限公司) ; Milli - Q 超 纯 水 系 统 ( 美 国 Millipore 公 司) ; ST16R 高速冷冻离心机( 美国 Thermo 公司) 。

1. 2 材料

试剂: 甲醇( 质谱级,德国 Merck 公司) ,乙腈( 质谱级, 德国 Merck 公司) ,乙酸乙酯( 色谱级,天津市康科德科技 有限公 司) ,甲 酸 ( 色 谱 级,德 国 Merck 公 司) ,超 纯 水 ( Milli - Q 制备) ,肝素钠( 160 μ/mg,南京奥多福尼生物科 技有限公司) 。试药: 加参片提取物( 批号 20161103,天士 力研究院现代中药研发中心提供) 。动物: 雄性 Wistar 大 鼠,体质量( 200 ± 20) g,购自北京维通利华实验动物技术 有限公司。

2 方法

2. 1 色谱与质谱条件

2. 1. 1 色谱条件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 ( 2. 1 mm × 100 mm,1. 7 μm) 。流动相 0. 1% 甲酸水( A) - 甲醇( B) ; 梯度洗脱: 0 ~ 3 min,10% ~ 10% B; 3 ~ 11min, 10% ~ 20% B; 11 ~ 21 min,20% ~ 40% B; 21 ~ 35 min, 40% ~ 70% B; 35 ~ 37 min,70% ~ 95% 。流速 0. 3 mL· min - 1 ; PDA 全波长扫描; 柱温 30 ℃ ; 进样量 2 μL。

2. 1. 2 质谱条件

采用电喷雾离子化源( ESI) ,MSE 扫描 正负离子模式检测,扫描范围 m/z50 ~ 1500,用亮氨酸脑啡 肽作校正液,进行实时校正。毛细管电压负离子模式 2. 3 kV,正离子模式 2. 8 kV,锥孔电压为 40 V,雾化气为高纯度 氮气,流速为 50 L/h,碰撞气为氩气,脱溶剂气流速 800 L/ h,脱溶剂温度为 350 ℃,离子源温度为 120 ℃。高能量扫 描时 trap 电压为 20 ~ 60 eV。

2. 2 灌胃液制备

按照加参片中药材提取工艺对各药材进行提取,其中丹参、香加皮、黄芪、三七采用稀醇提取大孔树脂纯化等技 术制备提取物,桂枝、益母草等采药材用水提醇沉等技术得 到提取物,经现有的内控质量标准检验为制备加参片制剂 合格的加参片提取物,按比例混合。取加参片全方提取物 2. 758 g,缺香加皮阴性提取物 2. 64 g,香加皮提取物 0. 122 g,各 加 10 mL 二 纯 水 溶 解,制 得 浓 度 分 别 为 0. 275 8, 0. 264,0. 012 2 g /mL 的供试品溶液。

2. 3 血浆样品的制备

Wistar 大鼠适应 1 周后,将 8 只大鼠随机分为 4 组,3 个给药组( 加参片提取物全方组、缺香加皮阴性提取物组、 香加皮提取物组) 每组 2 只,空白组 2 只。实验前禁食 24 h,自由饮水,给药组分别以 4. 137、3. 95、0. 183 6 g /kg( 均基 于预实验结果确定) 的给药量灌胃加参片提取物全方提取 液,缺香加皮阴性提取物提取液,香加皮提取物提取液,分 别在 5 min、15 min、30 min、45 min、1 h、1. 5 h、2 h、3 h、5 h、7 h 眼静脉从采集血液各 500 μL,血液置于含有肝素钠的 EP 管中,4500 r/min 离心 10 min ,取上清液血浆。各点各取 150 μL,加 4 倍量甲醇,涡旋振荡 2 min,离心 15 min( 4 ℃, 14 100 r/min) ,取上清液,35 ℃氮气吹干,再加入 100 μL 初 始流动相复溶( 甲酸水 - 甲醇 9 ∶ 1) ,超声 1 min,涡旋振荡 2 min,离心 15 min( 4 ℃,14 100 r/min) ,上清液转移至液 相内插管中待用分析。

3 结果

含药血浆、空白血浆各进样 4 μL,按 2. 1 项下的色谱 与质谱条件进样分析,采用 MSE 扫描正负离子检测,获得 的正、负离子模式下的 BPI 图通过色谱保留时间、质谱准分子离子峰信息( MS) 、碎 片离子信息( MS /MS) ,及在加参片提取物 化学成分研究的基础上,共指认出 14 个入血原型成分 ( 表 1) ,5 个代谢产物。M2、M3: 负离子模式下,在 m/z 459. 09 的提取流色谱 图中,可以检测到两个代谢产物的色谱峰,保留时间分别为 20. 337 min( M2) 和 25. 675 min( M3) 。其中 M2 的二级质 谱中出现 m/z 459. 091 7,m/z 283. 057 8,m/z 268. 034 2, m/z 175. 019 0 等一系列碎片离子,体外样品溶液毛蕊异黄 酮 - 7 - O - b - D - 葡萄糖苷也出现 m/z 283. 057 8,m/z 268. 034 2 的碎片离子,毛蕊异黄酮的[M - H]- 分子离子 m/z 283. 057 8 比 m/z 459. 092 2 多 176 Da,M3 的二级碎片也存在 m/z 283. 057 3,m/z 269. 040 6,m/z 175. 008 8 的碎 片离子,且 M2 的峰面积大于 M3,依据碎片离子信息推断 M2 为毛蕊异黄酮 - 7 - O - b - D - 葡萄糖 醛酸,M3 为毛蕊异黄酮 - 3’- O - b - D - 葡萄糖醛酸( m/ z 175. 019 0 是葡萄糖醛酸的特征离子峰) 。

4 讨论

课题组前期进行的加参片提取物化学成分研究中, 所开发的方法在入血成分分析中仍然适用,所以本实验所 采用的色谱与质谱方法同前期开发加参片提取物化学成分 方法一致。给药血浆各采血点各取 20 μL 血浆 混合,加入 4 倍量甲醇,涡旋振荡 2 min,离心 15 min( 4 ℃,14 100 r/min) ,取上清液,35 ℃ 氮气吹干,再加入 100 μL 初始流动相复溶( 0. 1% 甲酸水 - 甲醇 9 ∶ 1) ,超声 1 min, 涡旋振荡 2 min,离心 15 min( 4 ℃,14 100 r/min) ,上清液 转移至液相内插管中,采用液质联用技术分析检测。以峰个数、分离度、峰面积的大小等因素来确定血浆处 理方法。由图 3 可以看出,乙酸乙酯萃取处理法,出峰个数 较少,其更适用于中等极性或者弱极性的成分,而对极性较 大的成分选择能力较弱。基于加参片提取物前期化学成分 的研究,方中极性成分占多数,故舍弃乙酸乙酯萃取法。 有机溶剂甲醇沉淀法,出峰个数较多,富集度高,分离效 果也较好,且得到的峰面积较乙腈沉淀法和甲醇乙腈沉 淀法高,最终确定用甲醇沉淀法作为血浆的前处理方法。




 


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